兔主动脉内皮细胞的分离培养及生物学特性

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摘要：0 引言 Introduction 血管内皮细胞除具有屏障功能外，还具有止血、抗凝、纤溶、细胞通透性、选择性屏障、血液传输、血管活性物质代谢等作用，在调节血管运动张力、产生生长因子及纤

0 引言 Introduction

血管内皮细胞除具有屏障功能外，还具有止血、抗凝、纤溶、细胞通透性、选择性屏障、血液传输、血管活性物质代谢等作用，在调节血管运动张力、产生生长因子及纤维基质增生等方面起着重要的作用[1]；另外其参与炎症反应[2-3]，与动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾衰、肿瘤、休克及弥散性血管内凝血等疾病的发生发展密切相关[2-7]，因此，对血管内皮的研究显得尤为重要。对血管内皮细胞的体外成功培养是研究其生理、病理功能及在多种疾病发生发展中作用的基础，而原代培养的主动脉内皮细胞常混有其他细胞，现有的组织块移植和机械刮取法等原代细胞培养方法均很难得到高纯度的主动脉内皮细胞[8-9]，此次实验成功地在体外进行了兔主动脉内皮细胞的原代培养、传代和鉴定，旨在寻找一种简单、经济、高纯度、重复性强的实验方法，为创建内皮细胞模型及后续实验打下基础。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 单一样本观察实验。

1.2 时间及地点 于2012 年6 至10 月在天津中医药大学国家中医药管理局病理三级实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 主要试剂 M199 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购于Hyclone 公司；Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ型胶原酶均购于Sigma 公司；鼠抗兔CD34 多克隆抗体购于北京中杉金桥公司。

1.3.2 实验动物 2 月龄雄性日本大耳白兔，普通级，体质量1.8-2.0 kg，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2007-0001，防疫合格证号：。在天津中医药大学动物饲养中心适应性喂养1 周，自由进食饮水，保持生活环境通风及清洁卫生，观察进食、饮水、活动、尿便情况，并确认为健康日本大耳白兔，用于兔主动脉内皮细胞的分离、培养。

实验过程中对动物的处置符合2006 年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[10]，经天津中医药大学动物实验伦理委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 内皮细胞的原代培养 2 月龄日本大耳白兔在天津中医药大学动物饲养中心适应性喂养1 周，并确认为健康日本大耳白兔后，用乙醚将其吸入麻醉，固定动物。用水湿润日本大耳白兔颈、胸、腹部位，绷紧皮肤进行被毛，用弯头手术剪剪去颈、胸、腹部位的兔毛，头部用体积分数75%的乙醇棉球消毒3 遍，自颈部以下置于体积分数75%的乙醇中浸泡5 min，在无菌环境中，自兔颈部以下用碘伏消毒2 次，用体积分数75%的乙醇脱碘2 次。

于前正中线自下而上打开腹腔和胸腔，将脏器摆放至不影响操作的一侧，注意不要触破膀胱和血管，充分暴露心脏。沿脊柱钝性分离腹主动脉，于横隔段至髂总动脉段取下；小心剪开心包，钝性分离胸主动脉，于主动脉根部至横膈段取下，将腹、胸主动脉置于无菌培养皿中，用含5%青链霉素的PBS 冲洗3 次。

分别于近心端剪一环形切口，纵向剪开血管，内膜面向下铺入装有2 g/L Ⅰ型胶原酶、2 g/L Ⅱ型胶原酶、2 g/L Ⅲ型胶原酶、2 g/L Ⅳ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶混合消化液(按1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶4 混合)的培养皿中，于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中消化约10 min 后，镜下观察有较多细胞消化下来即可。再按1 ∶1 体积向装有内皮细胞的培养皿中加入培养基以终止消化。用无菌不锈钢镊子轻轻地将内膜层刮几遍，使血管内皮细胞脱落于培养液中，用移液器将刮下来的细胞悬液，移入15 mL 的离心管中，以1 000 r/min×6 min 离心，弃上清，用M199 培养基(含胎牛血清20%、青链霉素2%)混匀沉淀细胞，吹打分散至单个细胞，用移液器将其转移至用多聚赖氨酸包被的24 孔板内，置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养，于倒置相差显微镜(×50)下观察内皮细胞生长情况：24 h 细胞贴壁，48 h 后用首次半定量法换液，去除部分细胞碎片和未能贴壁的细胞。

1.4.2 细胞成活率测定 原代细胞培养24 h 后，用倒置相差显微镜(×50)观察细胞培养结果。取出在CO2培养箱中的24孔板，向其中一孔加入0.25%胰蛋白酶消化液0.5 mL，显微镜下观察，待细胞收缩变圆后，加入1.5 mL 培养基轻轻吹打，用移液器将其移入15 mL 的离心管中，24 孔板放回37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中，将15 mL 离心管以1 000 r/min×6 min 离心，弃上清，取M199 培养基(含胎牛血清20%、青链霉素2%)1 mL 混匀沉淀细胞，使细胞充分悬浮，用移液器取0.5 mL 单细胞悬液移入1.5 mL EP 管中，按1 ∶1 比例滴加0.4%锥虫蓝溶液0.5 mL，混匀，将其缓慢从计数板的边缘滴入，以便填充计数板和盖玻片之间的空隙，稍候片刻，将计数板放在倒置相差显微镜(×400)下，用血球计数板计数活细胞和死细胞。

文章来源：《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2021/0728/738.html

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